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去垢劑

去垢劑是一類分子,其獨特的性質能夠操縱(破壞或形成)生物樣品中分子之間的疏水-親水相互作用。


分子生物學實驗室每天都使用去垢劑。它們存在于細胞裂解緩沖液(例如,質粒分離試劑盒)、電泳和印跡緩沖液中,最重要的是,它們用于清潔實驗室玻璃器皿和實驗室工作人員的手。對于這些常規應用,不需要詳細了解去垢劑的性能,它們只是起作用。當涉及到膜蛋白的分離和純化時,人們不能依賴常規方法。許多膜蛋白只在少量不同的去垢劑緩沖系統中穩定,最糟糕的是,不同的膜蛋白喜歡非常不同的去垢劑。不幸的是,去垢劑性能被認為是膠體科學或物理化學的領域,因此,盡管去垢劑的物理化學數據數量驚人,但這些數據很少以對生物化學家有用的方式進行匯編。



生物去垢劑通常用于破壞細胞的雙極脂質膜,從而釋放和溶解膜結合蛋白。一些去垢劑可被用于溶解重組蛋白,而另一些則被用于蛋白質的穩定、結晶和變性。去垢劑可以在水/非水界面處排列,從而降低表面張力,增加混溶性并穩定乳狀液。其他的去垢劑應用包括:


提取DNA和RNA

溶解標本用于診斷應用

細胞裂解

脂質體制備

防止溶液中的試劑和被分析物沉淀

防止免疫測定中的非特異性結合

去垢劑的物理特性

膠束開始形成時的濃度被稱作臨界膠束濃度(CMC)。CMC是單體的最大濃度,并且可以因此對形成膠束的自由能進行量度。CMC越低,膠束越穩定,并且分子并入膠束或脫離膠束的速度越慢。去垢劑疏水區域的結構會影響膠束的結構。離子型去垢劑疏水烴鏈的長度增加會導致膠束增大和CMC降低,同時構建膠束需要的分子也減少。


膠束中單體的平均數量被稱作聚集數。CMC和聚集數的值很大程度上取決于以下因素:溫度、pH、離子強度以及去垢劑的均一性和純度。用來測定CMC和聚集數的分析方法的不同可能會造成報道數值的輕微差異。聚集數的值也會因濃度而變化,當濃度高于CMC時,單位膠束中的去垢劑分子數目會增加。


易于去除或交換是選擇去垢劑時需考慮的一個重要因素。一些常見的去除去垢劑的方法包括:


透析

凝膠過濾色譜

疏水吸附色譜

蛋白沉淀

去垢劑相關的CMC值是疏水結合強度的重要參考。去垢劑的CMC值越高其結合越弱,相應的也越容易通過透析或置換方法去除。而CMC值較低的去垢劑則只需要較少的去垢劑就可以形成膠束并溶解蛋白質或脂質。


另一個用于評估后續去除去垢劑難易度的有用參數是膠束分子量,表示相對膠束大小。越小的膠束越容易去除,在基于蛋白質分子尺寸的蛋白質-去垢劑復合物分離時效果也更理想。膠束分子量可以用單體分子量乘上聚集數來計算。


濁點是指當濃度接近或高于CMC時,去垢劑溶液分離成兩相的溫度。膠束聚集,形成高去垢劑濃度的混濁相,而溶液達到平衡點時會耗盡去垢劑。得到的兩相溶液可以被分離,提取出的蛋白質位于富含去垢劑的相中。因為高濁點溫度會造成溶解蛋白質的變性,因此在蛋白質存在時推薦使用低濁點的去垢劑,例如TRITON??X-114 (濁點~23 °C)。去垢劑濃度和溫度的變化以及添加鹽或聚合物(例如葡聚糖和聚乙二醇)等因素都會影響濁點。需要注意的是富含去垢劑的相也取決于去垢劑的種類和鹽濃度;在某些條件下,相可以是澄清的而不是混濁的,可以作為溶液的上相或下相。對于非離子型去垢劑,這一特點已被用于膜蛋白的相分離和提純。


去垢劑的種類和選擇

選擇去垢劑時,首先需要考慮的通常是親水基團的組成:


根據分子結構,去垢劑可大體分為:


離子型

兩性離子型

非離子型

離子型去垢劑

離子型去污劑含有陰離子或陽離子頭部基團,并具有凈電荷。它們的疏水尾巴要么是直鏈烴鏈(例如十二烷基硫酸鈉(SDS)和十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)),要么是剛性甾體基團(例如膽汁酸鹽)。離子去污劑膠束的大小取決于 側鏈的疏水引力和離子基團的斥力。因此,通過增加中和頭部基團上電荷的抗衡離子濃度,可形成較大的膠束尺寸。膠束的大小也隨著烷基鏈長度的增加而增加。離子去污劑在膜蛋白增溶方面非常有效,但難免或多或少造成變性5。


膽汁酸鹽是陰離子去垢劑,具有由剛性甾族基團(例如膽酸和脫氧膽酸的鈉鹽)組成的主鏈。由于為平面結構,這些分子具有極性和非極性的表面;因此,它們的CMC較高且其膠束較小,易于通過透析去除。6膽汁酸鹽是相對溫和的去垢劑,與同頭部基團的線性鏈去垢劑相比,其失活性通常較小。7未偶聯的膽汁酸鹽單體pKa值約為5-6,在低pH值下溶解度有限。但是,在任何給定的pH值下,膽汁酸偶聯都會降低pKa,產生更大比例的離子化分子。由于離子鹽形式比質子化酸形式更易溶于水,因此在低pH值下,偶聯可增加溶解度8。


非離子型去垢劑

非離子型洗滌劑含有不帶電荷的親水性頭基,由聚氧乙烯部分(如BRIJ?和TRITON?去垢劑)或糖苷基團(如辛基葡糖苷和十二烷基麥芽糖苷)組成。由于非離子型去污劑會破壞脂質-脂質和脂質-蛋白質的相互作用,但不會破壞蛋白質-蛋白質的相互作用,因此被認為是非變性。9 因此,它們廣泛用于分離生物活性形式的膜蛋白。與離子型去垢劑不同,鹽對非離子型洗滌劑的膠束尺寸影響極小。5


具有聚氧乙烯頭基團的去垢劑可以包含烷基聚乙烯醚(CnH2n+1(OCH2CH2)xOH),或烷基鏈與醚基之間包含苯環。TRITON?X-100去垢劑屬于后一類。需要注意的是,含有芳香環的去垢劑在紫外線區域吸收。它們可能會干擾分光光度法280 nm處的蛋白質監測。這些去垢劑可提供氫化形式,其中芳香環被還原以消除紫外線吸收。但是,在這種還原制劑中可能存在少量未反應的材料。在某些應用中,具有脂族疏水部分的市售聚氧乙烯去垢劑可以代替某些芳族聚氧乙烯。例如,在紫外線不可見光波長應用中,通??刹捎肨ERGITOL? 15-S-9、TERGITOL? TMN-10、聚氧乙烯10月桂基醚和聚氧乙烯10十三烷基醚代替TRITON?X-100。這些去垢劑具有脂族疏水部分,因此不會明顯吸收紫外線區間波長。


盡管聚氧乙烯比合成的非離子型去垢劑(如烷基糖苷)具有明顯的成本優勢,但由于兩大原因,后者在許多應用中仍是首選去垢劑。首先,它們的組成和結構均一。其次,可利用它們輕松合成幾種包含不同烴鏈和極性糖基組合的烷基糖苷變體??衫酶浇拥狡咸烟?、麥芽糖或蔗糖頭基上,帶有各種烷基鏈的烷基糖苷的理化性質細微差異,選擇性溶解膜蛋白。10


兩性去垢劑

兩性去垢劑同時具有離子型和非離子型去垢劑的特點。和非離子型去垢劑一樣,兩性去垢劑不具有凈電荷,無導電性和電泳遷移性,且不與離子交換樹脂結合。但和離子型去垢劑一樣,它們可以有效地破壞蛋白質間的相互作用。與線性鏈兩性離子去垢劑(例如十二烷基二甲基二胺氧化物)相比,固醇類兩性去垢劑(例如CHAPS)的變性概率較小。


非去垢劑磺基甜菜堿

非去垢劑磺基甜菜堿(NDSB)是兩性離子化合物。和去垢劑磺基甜菜堿(SB)– 例如線性SB(例如SB 3-16、SB 3-10、3-12 后文 3-14)、 CHAPS和氨基磺基甜菜堿(例如N-烷基氨基丙基-N,N二甲基氨基烷基磺酸鹽)一樣 – NDSB帶有磺基甜菜堿親水性頭基。但與SBs相比,NDSB中的疏水基太短,即使濃度高達1 M時也無法形成膠束。因此,NDSB易于通過透析去除,且易于在色譜基質和聚丙烯酰胺凝膠中擴散,適用于電泳應用。


NDSB首先用于天然等電聚焦實驗中,以在不增加電導率的情況下篩選靜電相互作用。從那時起,它們被廣泛應用,包括蛋白質的增溶和結晶,以及化學和生物變性蛋白質的復性和重折疊。16憑借短疏水基團和電荷屏蔽作用,NDSB可防止聚集并提高膜蛋白產量。此外,NDSB不會干擾涉及硝基苯基的顯色底物的酶法測定,且不會抑制酶(例如β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶)的活性。14值得注意的是,NDSB-195、NDSB-211和NDSB- 221不吸收280 nm波長的光線;因此,它們與蛋白質純化程序兼容,可在蛋白質純化過程中通過測量該波長吸光度監測蛋白質濃度。


去垢劑選擇指南

如果裂解液或勻漿100,000 x g離心1小時后上清液中存在膜蛋白,則認為該膜蛋白已溶解。在大多數情況下,去垢劑溶解后,會在上清液中保留蛋白質的生物學活性。因此,適當的去垢劑會在上清液中產生大量生物活性蛋白。鑒于當今市面上的去垢劑種類眾多,選擇合適的去垢劑可能會很困難。下面概述了部分有助于選擇合適的去垢劑的要點。


查閱文獻,嘗試使用先前已用于分離和表征類似生化或酶學性質的蛋白質的去垢劑。

考慮去垢劑在工作溫度下的溶解度。例如,丙磺酸二甲基棕櫚酰胺(SB3-16)在4°C下不溶于水,而TRITON?X-114去垢劑在室溫下會發生相分離。

考慮去垢劑去除方法。如果要進行透析,顯然優選高CMC去垢劑。如果使用離子交換色譜,則非離子或兩性離子去垢劑更佳。

保留活性生物或酶活性可能需要試驗幾種去垢劑。除去垢劑種類外,去垢劑用量也會影響蛋白質活性。對于某些蛋白質,僅可在很窄的去垢劑濃度范圍內保留其生物學活性。低于該范圍,蛋白質不溶解;高于特定濃度,蛋白質滅活。

考慮下游應用。由于TRITON?X-100去垢劑含有260-280 nm吸收波長的芳環,因此如果操作規范要求紫外線監測蛋白質濃度,則應避免使用這種去垢劑。同樣,如果要等電聚焦分離蛋白質,則應避免使用離子型去垢劑。進行蛋白質凝膠過濾時,應考慮使用聚集數較小的去垢劑。

考慮去垢劑純度。應使用純度盡可能高的去垢劑,因為目前確知某些去垢劑(例如TRITON?X-100)含有過氧化物污染物。

對于存在DNase、RNase和蛋白酶等污染問題的任何研究,可使用多種分子生物學級去垢劑。

與有毒去垢劑相比,優先選擇無毒去垢劑。例如,洋地黃毒苷(洋地黃甙)需要特別小心處理。

由于未知的原因,某些去垢劑通??梢愿玫赜糜谔囟ǚ蛛x程序。例如,目前已發現正十二烷基-β-D-麥芽糖苷是用于分離細胞色素C氧化酶的首選去垢劑。因此,可能需要通過一些“試錯”方法,確定分離生物活性膜蛋白的最佳條件。

有時很難找到理想的去垢劑溶解和分析特定蛋白質。在這種情況下,通??梢杂靡环N去垢劑溶解蛋白質,然后再用對實驗影響最小的另一種去垢劑代替。

在某些情況下,已觀察到隔離緩沖液中含有磺基甜菜堿(NDSB)去垢劑可大幅提高可溶性膜蛋白產量。

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